生信之旅

一、简介

HLA即人类白细胞抗原（human leukocyte antigen），是编码人类的主要组织相容性复合体（MHC）的基因。其位于6号染色体的短臂上（6p21.31），包括一系列紧密连锁的基因座，与人类的免疫系统功能密切相关。其中部分基因编码细胞表面抗原，成为每个人的细胞不可混淆的“特征”，是免疫系统区分自身和异体物质的基础。

图1-1：HLA在染色体上的位置（来源于维基百科）

HLA基因可分为3大类：

• HLA-I型基因包括了HLA-A、HLA-B、HLA-C（HLA-E、F、G）等抗原基因；
• HLA-II型基因包含了HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DN和HLA-DO等系列基因；
• HLA-III型基因与前两型不同的是第三类MHC分子主要属于补体系统，参加不分别免疫。它可下分为C2、C4和BF等

HLA等位基因命名见下图所示：

图1-2：HLA命名

1. HLA是固定前缀；
2. A代表基因名称，前缀和基因名称之间用短横线连接；
3. *星号作为分隔符，分隔符之后是同一个基因的不同allel,由冒号分隔的多个部分构成，最多包含4个部分；
4. 第一组02代表不同的血清学类型，根据血清学鉴定的结果对不同抗原进行分类；
5. 第二组101代表一种特定类型的蛋白；
6. 第三组的01代表发生在编码区的同义突变；
7. 第四组的02代表发生在非编码区的基因突变；
8. N为后缀，代表了蛋白的表达水平。

• 每一个HLA的Allel都会有一个唯一的ID,有时会在这些ID后面添加不同的后缀，不同后缀的含义不同（N、L、S、Q、C、A），具体解释如下：
• N表示该等位基因不表达；
• L代表low, 表示这种allel的表达水平相比正常水平要低；
• S表示蛋白产物不是位于细胞表面，而是一种可溶性的分泌蛋白；
• C表示蛋白产物不是位于细胞表面，而是位于细胞质中；
• A表示不确定这个allel的蛋白产物是否存在；
• Q表示这个allel会对其他等位基因的表达造成影响。

下面介绍两个基于高通量数据进行HLA分型的软件HALscan和OptiType。

二、HLAscan

HLAscan是一个基于比对的程序，在考虑read分布的情况下确定hla单倍型，可免费用于学术用途，商业下载和安装需要许可。github地址为：https://github.com/SyntekabioTools/HLAscan

下面介绍下它的安装使用：

wget -c https://github.com/SyntekabioTools/HLAscan/releases/download/v2.1.4/hla_scan_r_v2.1.4
chmod a+x hla_scan_r_v2.1.4
mv hla_scan_r_v2.1.4 ~/.local/bin/hla_scan  # 为方便使用，将其移动到个人PATH路径下，并重命名

下载对应的测试集并解压：

wget -c https://github.com/SyntekabioTools/HLAscan/releases/download/v2.0.0/dataset.zip
unzip dataset.zip

需要注意的是，解压后不仅有测试集还有对应的数据库，下面我们使用其来进行HLA分型：

hla_scan -b data/NA12155.chr6.bam -d db/HLA-ALL.IMGT -v 38

其结果如下：

=====================================================
HLAscan v2.1
Report created
2021. 12. 16.	14:39:13
========================================================
HLA gene : HLA-A
# of considered types : 3182

----------- HLA-Types -----------
[Type 1]	01:11N	EX3_3.29348_45	EX2_3.75926_100	EX4_24.0471_100	EX5_35.1966_100	
[Type 2]	01:11N	EX3_3.29348_45	EX2_3.75926_100	EX4_24.0471_100	EX5_35.1966_100	

由于软件直接输出到终端上，所以平时我们运行的时候可以使用管道将输出重定向到文件中。除了bam文件外，HLAscan的输入还可以是fq文件：

hla_scan -l [fastq] (-r [fastq2]) -d [IMGT/HLA DB]

三、OptiType

OptiType 是一种基于整数线性规划的新型 HLA 基因分型算法，能够通过同时选择所有主要和次要 HLA I 类等位基因，从 NGS 数据中产生准确的 4 位 HLA 基因分型预测。github地址为：https://github.com/FRED-2/OptiType

其安装有几种方式，推荐使用conda进行安装，虽然也可以从源码编译，但是建议不熟悉编译的不要尝试，出错的话比较麻烦。

conda install optitype
或者
docker pull fred2/optitype

在使用OptiType进行HLA分析之前，建议先过滤出待分析序列中的HLA序列，这将能节省程序的运行时间，官方推荐使用RazerS3来进行比对，不过该软件会将序列读入到内存中，所以需要机器内存比较大。

在进行比对之前需要先下载对应的hla参考序列：https://github.com/FRED-2/OptiType/tree/master/data

测试数据：https://github.com/FRED-2/OptiType/tree/master/test

razers3 -i 95 -m 1 -dr 0 -o fished_1.bam hla_reference_dna.fasta sample_1.fastq  # 进行比对
samtools bam2fq fished_1.bam > sample_1_fished.fastq  # 将bam文件转为fq文件
rm fished_1.bam

对于双端文件的话，官方建议单独过滤双端文件，及fq1和fq2需要分别单独运行上诉命令。暂时不清楚这是为什么！

python OptiTypePipeline.py -i sample_1_fished.fastq （sample_2_fished.fastq） --dna -v -o output_dir -p out_prefix

上诉命令即可进行HLA分型，若是双端文件可以同时进行分析，我这里使用括号括起来，表示可选，如果你的是RNA数据，需要把--dna改为--rna

最终将会在结果目录下生成两个文件：*_coverage_plot.pdf 和 *_result.tsv。

结果如下所示：

	A1	A2	B1	B2	C1	C2	Reads	Objective
0	A*31:01	A*30:01	B*13:02	B*51:02	C*06:02	C*15:02	11426.0	10911.81

图3-1：*_coverage_plot 结果

四、参考

1. 世界卫生组织 HLA 系统因素命名委员会
2. 维基百科
3. 百迈客
4. HLAscan
5. OptiType