生信之旅

作为生物dog，相信分子生物学实验做的不少（当然，因为专业原因，我虽然做过，但是很少），而这个往往离不开引物设计，在引物设计完成后，我们如何验证引物的特异性，防止扩增的时候引入杂带呢？下面我将介绍两种方法进行校验，希望能对你有所帮助！

一、primer-blast

primer-blast是NCBI平台下的一个引物设计软件，其使用Primer3 设计 PCR 引物，同时使用blast和全局比对算法在用户选择的数据库中进行检索，来避免非特异性的引物。所以如果你是用primer-blast进行引物设计的话，可根据其结果进行引物特异性的判断，或者你也可以将你从其他地方设计的引物输入到primer-blast程序进行判断，这里将介绍后一种方法。

首先打开primer-blast官网 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi ，在对应的位置输入相应的引物序列，PCR Template留空即可，其他参数默认。

这里我们从网上随意找一对引物

F: CAGCCCCCTTCGCCCCGAGAGGGCCCTCTGCCT

R: ACCCTAGAGTCTCATTGGGCAGGGCC

图1-1：输入引物信息

输入完引物序列后，在下方选择需要比对到的数据库，以及对应的物种

图1-2：选择数据库及物种

上诉全部输入完成后，点击Get Primers 运行程序即可。等一会结果就会出来了，像下诉这种结果我们可以看到只有一条记录，这种情况下特异性就很好了，如果有多个记录的话，看是否能通过长度等条件筛选，如果不能的话，建议重新设计过吧。

图1-3：结果

二、blast

除了用primer-blast来进行引物特异性验证外，我们还可以直接使用blast来进行。

首先打开blast官网 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome ，将前置引物和后置引物按顺序连接起来，在中间输入几个n（代表未知碱基，或者你也可以分别对前置引物和后置引物进行blast），而后在下方选择对应的数据库和物种。

图2-1：引物输入

其次，比较重要的是，需要在算法参数中，将word size更改为比前置引物以及后置引物长度都要小的值，否则对结果会有影响，其他参数可默认。

图2-2：算法参数设置

设置完后点击blast即可。

图2-3：结果

我们从上诉结果中可以看到，前置引物和后置引物均比对上了，对应到参考序列的位置和primer-blast的结果是一致的。

三、总结

使用primer-blast或者blast进行引物特异性识别都是可行的，使用primer-blast相对来说比较方便，但是对于批量引物验证比较麻烦，因为其没有本地版，而使用blast则可以使用本地版，编写程序来进行批量处理。当然，由于个人学识有限，同时对于实验接触的少，难免有疏漏的地方，欢迎大家指正！共同学习，共同进步！